صبغة جرام
Gram Stain
يعرف هذا النوع من الصبغ أيضاً بالصبغ المركب Compound staining أو الأصباغ التميزية ويعتبر العالم Christian Gram عام 1884م أول من رصد تلك الظاهرة، لذلك فهي تعرف باسمه وهي تمييز بين مجموعات بكتيرية مختلفة .
تتكون صبغة جرام من أربعة محاليل مختلفة :
1- صبغة قاعدية " الكريستال البنفسجي" وتعتبر الصبغة الأساسية .
2- محلول "اليود" .
3- عامل مزيل للون "الكحول" .
4- صبغة مضادة "السفرانين .
عند إتباع هذه الطريقة نجد أن
بعض أنواع البكتيريا تصطبغ بالصبغة القاعدية في وجود اليود، بدرجة لا يمكن معها إزالة الصبغة من الخلايا عن طريق الغسيل بالكحول أو الأسيتون في حين أن البعض الآخر من خلايا البكتيريا يمكن إزالة الصبغة منها بسهولة باستعمال الكحول، والمجموعة الأولى من البكتيريا تعرف بالبكتيريا الموجبة لتفاعل جرام positive Bacteria Gram، أما المجموعة الثانية فهي تعرف بالبكتيريا السالبة لتفاعل جرام Gram negative Bacteria ، ولتسهيل رؤية خلايا المجموعة الثانية تستعمل صبغة أخرى ذات لون أحمر مثل السفرانين واتي تضاف بعد الغسيل بالكحول وتسمى الصبغة العكسية،حيث تصطبغ الخلايا بعدها باللون الأحمر.
الأدوات والمواد اللازمة :1- نحضر مزارع حديثة العمر Young cultures، عمرها من 18-24ساعة ، ( لأن المزارع القديمة تميل إلى فقد خاصية الصبغ الموجب ) و نجهز منها معلق بكتيري مناسب.
2- صبغة الكرستال البنفسجي, كحول اثيلي, محلول يود و صبغة الصفرانين .
3- زيت سيدر .
4- شرائح زجاجية وابر خاصة بالبكتريا.
طريقة الصبغ :1- باستخدام إبرة العزل نأخذ نقطة من المعلق البكتيري علي الشريحة النظيفة .ونفردها علي الشريحة ثم نثبت علي اللهب.
2- نصبغ الغشاء بمحلول بالكريستال البنفسجي لمدة دقيقة.
3- نتخلص من محلول الصبغة ، ثم نغسل الشريحة بالماء الجاري الخفيف.
4- نغمر الغشاء بمحلول اليود، ونتركه لمدة دقيقة .
5- نتخلص من محلول اليود ، ثم نغسل الغشاء بالماء الجاري الخفيف.
6- نترك الشريحة لتجف في الهواء .
7- نغسل الغشاء بمحلول الإيثانول (95%)، وذلك بإضافته للشريحة قطرة قطرة مع إمالة الشريحة ليتساقط منها الكحول بعد مروره على الغشاء ، وتستمر الإضافة حتى يصبح الكحول المتساقط يكاد يكون عديم اللون.
8- نغسل الغشاء بعد ذلك بالماء الجاري الخفيف.
9- نغمر الغشاء بمحلول السفرانين لمدة نصف دقيقة.
10- نتخلص من محلول الصبغة ، ثم اغسلي بالماء الجاري الخفيف.
11- نترك الشريحة في الهواء كي تجف تماما ، ويمكن الإسراع من عملية التجفيف بتعريض الشريحة إلى الهواء الساخن فوق لهب بنزن.
12- نضع نقطة بسيطة جداً من زيت السيدر على الغشاء الميكروبي.
13- نفحص الشريحة بإستعمال العدسة الزيتية.
14- ندون المشاهدة ونعلق علي التجربة.
صبغة جرام
الطريقة تتألّف من ثلاث خطوات هي:
التلوين- إزالة التلوين- ثمّ التلوين المعاكس
1- في المرحلة الأولى يتمّ التلوين ببنفسجيّ غنتيان (أو المعروف بـ Crystal violet) المضاف إلى الفينول Phenol (المعروف تاريخيّا بالكاربول Carbol). البكتيريا الموجبة والسالبة حسب غرام تتلوّنان إذ ذاك.ثم تعالج البكتيريات بمحلول لوغول Lugol وتتكوّن حينها مركّبات من موادّ التلوين.
2- في الخطوة الثانية -وهي المهمّة- يختلف تفاعل البكتيريات، فبعد العلاج بالكحول -إيتانول (96%)- تفقد البكتيريا السالبة لونها المكتسب بدايةً بينما لا تتخلّى الموجبة عن لونها الأزرق الغامق الذي اكتسبته.
ويعود هذا الاختلاف إلى بناء الجدار الخلويّ لديهما فالبكتيريا السالبة تملك طبقة هزيلة من الموريين Murein لكن فوقها طبقة فوسفوليبيد Phospholipid.
بينما يتوفّر لدى الموجبة غلاف سميك من الموريين متعدّد الطبقات التي بينها يتجمّع محلول لوغول. وهنا يكون تأثير الإيتانول مجفّفًا حيث تبقى تجمّعات الألوان متوفّرةً في الجدار الخلوي.
هذه المرحلة -أي العلاج بالكحول- تتوجّب بعض الخبرة لتحديد تشخيصٍ أكيدٍ.
3- الخطوة الثالثة تشمل تلوّن البكتيريات بمحلول ملطّف -أي قليل التركيز- من الفوكسين المزاد إلى الفينول. (وبذلك ينتج اللون الأحمر لدى البكتيريات السالبة حسب تلوين غرام).
كما توجد طرق أخرى لمعرفة تصرّف البكتيريا حسب غرام مثل اختبار KOH.
[عدل]طريقة تحضير صبغة جرام (الصبغ المركب) لصبغ البكتريا السالبة والموجبة
(أ)صبغة الكريستال فايولت:
1. يذاب (1جرام) من بودرة كريستال فايولت قي (80 ملى كحول 85%) ثم يضاف (1جرام كالسيوم أكسالات) للمحلول السابق
2. يترك المحلول لمدة 24 ساعة قي الحضان عند درجة حرارة 25 درجة
3. ثم يكمل المحلول السابق إلى (1 ليتر) بالماء المقطر ويترك 24 ساعة أخرى قي الحضان عند نفس درجة الحرارة السابقة
4. يرشح المحلول بورق ترشيح للتخلص من بلورات الكالسيوم أكسالات الذائدة
ب)صبغة الصفرانين:
يذاب (2 جرام) من بودرة الصفرانين قي (ا ليتر) ماء مقطر
(ج) محلول لوجل اليودى:
1. يوزن (ا جرام) من اليود بالإضافة إلى
2. يذاب (1 جرام) من يوديد البوتاسيوم قي (300 مل) ماء مقطر