عزل الفطريات الممرضة للنبات

 

عزل الفطريات الممرضة للنبات

تعقيم وزرع النماذج


            غمر الأجزاء النباتية داخل كحول 70 % لمدة 17 ثانية في بداية الأمر ( بعد تشذيبها وتهيئتها للزراعة ، مثلاً قطعة من ساق أو جذور أو ورقة ) .

 

     تغمر في محلول كلوراكس 10 %   للساق و5 % للأوراق والأجزاء الغضة ، ولفترة 5 دقائق للساق و3 دقائق للأوراق .

 

     تجفف الأجزاء المعقمة آنف الذكر جيداً بوضعها بين طبقتين من ورق النشاف ( فلترببيبر) للتخلص من نمو البكتريا والتلوث .

 

     الزراعة على الوسط الغذائي الخاص PDA ( مكون من 200 غرام بطاطا مسلوقة و18 غرام آكرو20 غرام سكر أو سكروز) ،تكون زراعة النموذج بشكل عمودي أو مائل إذا كان ساق والفطر وعائي، وافقي إذا كان غير وعائي أو الأوراق بحيث يكون الجزء الذي يحمل الأعراض مواجه للوسط الغذائي . ويكون توزيع القطع المزروعة بشكل دائري قريب من الأطراف للطبق . ثم يغلق الطبق ويختم بالبارافيلم .

 

     بالنسبة للعزلات المحفوظة من فترة طويلة على أقراص الفلتر ببيبر ، فتستخرج قرص واحد مباشرة من أل  Vial ويزرع على الوسط ألزرعي المتخصص .

 

     يراعى استخدام الملقط واللوب في الزراعة على أن يغمر الملقط بالكحول الأثيلي ثم يحمى على مصباح اللهب جيداً ثم يبرد بالكحول ثم يستخدم ، كما يراعى أن تكون اليدين داخل الهود خلال العمل .


عزل السبور / البوغ بشكل منفرد
Single spore isolation


             تحضير أنابيب اختبار تحتوي على ماء مقطر معقم بالأوتوكليف وبحجم 2 سم3 .

             يستخدم المشرط أو اللوب بعد تعقيمه بالكحول ولهب مصباح البنزين في أخذ مسحة من الفطر ( مسحه سطحية) ، ثم وضعها داخل احد أنابيب الاختبار الحاوية على الماء المقطر المعقم ، ثم يرج جيداً .

             سكب الماء المقطر المعقم بمحتوياته (الموجود في أنبوب الاختبار) داخل طبق حاوي على وسط غذائي  PDA معقم ومهيأ مسبقاً ، يترك فترة قليلة لكي تستقر السبورات ( تترسب على الوسط ألزرعي ) بعدها يسكب الماء الزائد في  فلاسك

       ( يهمل  ) .

             يترك الطبق داخل الحاضنة ثم يفحص بالمكرسكوب في اليوم التالي لمراقبة إنبات السبورات .

             عزل السبور المفرد النابت مع قطعة من الوسط ألزرعي وزرعه على الوسط ألزرعي ثم يغلف الطبق بالبارافيلم ثم يوضع في الحاضنة وبدرجة حرارة الغرفة تحت إضاءة الفلوريسنت .



طريقة إكثار العزلات الفطرية الممرضة


      يوضع حجم 1 ـ 2 سم3  ماء مقطر معقم داخل الطبق الحاوي على عزلة الفطر الممرضة المتجرثمة .

      يحرك الطبق ، ويؤتى بشريحة زجاجية ( سلايد ) وتدعك وتقشط المزرعة الفطرية بحافة السلايد  ( بالعرض )، ثم يحرك الطبق .

      يصب الماء الحاوي على سبورات الفطر داخل طبق بتري آخر حاوي على وسط زرعي ، ثم بعد ثواني قليلة يصب الماء في طبق آخر وهكذا تكرر العملية إلى أن ينفذ الماء وفي المرحلة الأخيرة ينفظ الطبق جيدً للتخلص من الماء الزائد .

      تختم الأطباق بالبارافيلم ثم تحفظ في الحاضنة .







طريقة حفظ العزلات الفطرية الممرضة لفترة طويلة


             يؤتى بورقة فلتر بيبر تم تثقب بثاقبة أوراق عدة ثقوب للحصول على العديد من الأقراص الورقية النشافة .

             يؤتى بعبوات زجاجية صغيرة ذات أغطية محكمة ( Vials ) ذات حجم 2 سم 3 ويوضع فيها حجم 1 سم 3 أو 2 سم3 من معلق العزلة المراد حفظها ( يمكن الحصول عليها بالطريقة آنف الذكر ).

             توضع 10 قطع من الأقراص النشافة آنف الذكر داخل الحاويات الزجاجية أعلاه والحاوية على معلق العزلة ، بعدها يكتب عليها أسم العزلة ، ثم يترك داخ الثلاجة وعلى درجة حرارة -4 مئوي .



تعليقات

إرسال تعليق